胞核/胞漿蛋白分離提取實(shí)驗(yàn)小貼士（一）

更新時(shí)間：2025-11-20 | 點(diǎn)擊率：28

實(shí)驗(yàn)原理

利用低濃度去垢劑選擇性裂解細(xì)胞膜，同時(shí)保持核膜完整，然后通過(guò)差速離心進(jìn)行分離。

1.選擇性裂解：

使用含有低濃度非離子去垢劑的等滲緩沖液。這種濃度足以溶解細(xì)胞膜和胞漿膜結(jié)構(gòu)，但無(wú)法破壞結(jié)構(gòu)更堅(jiān)固的核膜。

2.差速離心：

通過(guò)控制離心力，可以初步將細(xì)胞核（沉淀）與胞漿成分（上清）分離開(kāi)。

1）低速離心：完整的細(xì)胞核是細(xì)胞中最大最重的細(xì)胞器，在較低轉(zhuǎn)速下（500-1,000g）即可沉淀。

2）高速離心：胞漿蛋白、細(xì)胞器（線(xiàn)粒體、微粒體等）需要更高的轉(zhuǎn)速（10,000g以上）才能沉淀。

操作步驟

第一步：細(xì)胞收集與洗滌：

1）吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基；

2）用預(yù)冷的PBS輕柔地洗滌細(xì)胞2次，充分洗去殘留的血清（血清中含蛋白酶）；

3）充分吸盡PBS。

Tip：使用胰酶處理貼壁細(xì)胞時(shí)要嚴(yán)格注意消化時(shí)間；胰酶會(huì)使細(xì)胞變得很脆弱，影響后續(xù)核質(zhì)分離；不同細(xì)胞種類(lèi)其核質(zhì)分離結(jié)果略有所不同。

圖片中左側(cè)為細(xì)胞數(shù)量是2×10⁶個(gè)數(shù)的CHO-S細(xì)胞（黃色細(xì)胞沉淀）；圖片右側(cè)為細(xì)胞數(shù)量1×10⁵個(gè)數(shù)的Raw（白色細(xì)胞沉淀），作為反面對(duì)照，細(xì)胞個(gè)頭較小，數(shù)量太少，對(duì)后續(xù)提出的蛋白濃度以及核漿分離結(jié)果有較大的影響。

第二步：細(xì)胞裂解：

1）加入一定量的裂解液裂解細(xì)胞；

2）渦旋振蕩10-15秒（或劇烈吹打），以充分裂解細(xì)胞。此時(shí)應(yīng)觀察到液體變得非常粘稠（因DNA釋放）；

3）冰上孵育10-15分鐘。此時(shí)，細(xì)胞會(huì)因裂解而變得粘稠，透亮。

Tip：2×10⁶個(gè)細(xì)胞體積通常為20μL，需要使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)密度后，再取2×10⁶個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。